De nieuwe aanpak heet iDEMS (isolatie van DNA door EdU-labeling voor massaspectrometrie).
Een recent technisch rapport binnen Natuur celbiologie heeft een nieuwe methode geïntroduceerd om specifieke veranderingen in te onderzoeken DNA volgende replicatie. Wetenschappers hebben een zeer gevoelige, kwantitatieve methode ontwikkeld die gebruikmaakt van massaspectrometrie, bekend als iDEMS (isolatie van DNA door EdU-labeling voor massaspectrometrie).
« Het nieuwe aan ons werk is dat we geen sequencing-methoden gebruikten die op dit gebied algemeen worden gebruikt, maar massaspectrometrie, wat de eerste keer is dat deze benadering is gebruikt om DNA-modificaties op gezuiverd, gerepliceerd DNA te meten », zegt Dr. Stewart-Morgan, mede-eerste auteur van het rapport, van het Groth-laboratorium van het Novo Nordisk Foundation Centre for Protein Research (CPR) aan de Universiteit van Kopenhagen.
Deze unieke aanpak is het resultaat van een gezamenlijk project met het Hajkova-laboratorium van het MRC London Institute of Medical Sciences (LMS). “In het Groth-laboratorium hebben we expertise in replicatie en het Hajkova-laboratorium heeft expertise in het bestuderen van DNA-methylatie door middel van massaspectrometrie. Ik denk dat deze multidisciplinaire samenwerking voor een groot deel de reden is waarom het project zo succesvol is geweest”, legt Dr. Stewart-Morgan uit. « De resultaten van ons onderzoek met iDEMS zijn definitief en openen nieuwe wegen voor toekomstig onderzoek. »
DNA-modificaties en celstabiliteit
Het genoom is de volledige set DNA-instructies die in een cel worden aangetroffen. Vrijwel alle cellen in een organisme bevatten dezelfde genetische informatie – maar welke genen tot expressie komen, is gebaseerd op de functie van de cel. Deze celspecifieke genexpressie wordt gereguleerd door het epigenoom van de cel, dat bestaat uit eiwitten die aan DNA zijn gebonden, evenals directe chemische modificaties aan DNA. Een van de belangrijkste epigenetische regulatoren is DNA-methylatie – een chemische marker die delen van het genoom uitschakelt die niet tot expressie mogen worden gebracht. Het patroon van deze markers is erg belangrijk bij het handhaven van de stabiliteit en identiteit van een cel: DNA-methylatie in een levercel zal bijvoorbeeld verschillen van het DNA-methylatiepatroon in een bloedcel.
Wanneer DNA wordt gerepliceerd tijdens celdeling, worden de epigenetische kenmerken die met het DNA zijn geassocieerd, inclusief DNA-methylatie, verdund. De nieuw gecreëerde DNA-strengen moeten het niveau en patroon van methylering herstellen om de controle over genexpressie, genomische stabiliteit en het epigenetische geheugen van de identiteit van de cel te behouden.
Veel over dit proces is echter onbekend, en verlies van DNA-methylatie is een veelvoorkomend kenmerk in cellen die zich vele malen hebben gedeeld, zoals kankercellen die zeer proliferatief zijn en verouderde cellen die zich in de loop van iemands leven vele malen hebben vermenigvuldigd. In de afgelopen jaren hebben verschillende groepen geprobeerd dit proces te onderzoeken met behulp van sequentiemethoden, maar de exacte kinetiek van post-replicatieve methylatiehandhaving bleef onduidelijk.
Herstel van methylering
Met behulp van iDEMS ontdekten de onderzoekers dat de DNA-methyleringsniveaus gestaag toenemen na replicatie, en na 4 uur waren de niveaus op gerepliceerd DNA en het genomische DNA gelijk. Dit geeft aan dat dit proces in een gestaag, langzaam tempo verloopt. Het wordt echter overtroffen door celdeling.
“Na verloop van tijd hebben cellen niet lang genoeg om hun methylering na replicatie te herstellen, en de methylering van het genoom wordt uiteindelijk verdund. Dit is de eerste keer dat een zeer duidelijke kinetiek voor herstel van methylering is aangetoond. Bovendien zagen we absolute kwantificering van de niveaus van DNA-methylatie, waardoor we konden onderscheiden welke methylatiekenmerken nieuw waren vastgesteld. Dit gaf ons vertrouwen in onze kinetische metingen”, meldt Dr. Stewart-Morgan.
Een tweede chemische marker
De onderzoekers gebruikten iDEMS ook om een tweede merker te bestuderen – DNA-hydroxymethylering – wat een veel zeldzamere genomische merker is dan methylering. Hun resultaten bevestigden eerder onderzoek, zegt dr. Stewart-Morgan: « We ontdekten dat één DNA-streng, de sjabloon of ‘ouderlijke’ streng, altijd meer hydroxymethylering heeft dan de andere ‘dochter’-streng, wat eerder werk ondersteunt dat aangaf dat deze marker DNA onderscheidt strengen op basis van leeftijd, ‘zegt ze.
« We ontdekten echter ook dat er geen punt is waarop de niveaus van hydroxymethylering gelijk zijn tussen de ouder- en dochterstrengen gedurende de celcyclus. Dit roept nieuwe vragen op over hoe dit verschil tussen strengen door cellen kan worden gebruikt, bijvoorbeeld tijdens DNA-herstel.”
Het potentieel van iDEMS
Door DNA-modificaties op gerepliceerd DNA direct te kwantificeren, lost iDEMS de kinetiek van DNA-methylatie en hydroxymethylering na DNA-replicatie op. « iDEMS is een dynamische en informatieve tool voor het aanpakken van belangrijke vragen in epigenoomonderhoud en DNA-modificatiebiologie », zegt Dr. Stewart-Morgan.
Met het oog op de toekomst zal iDEMS nuttig zijn bij het profileren van de dynamiek van methylering en hydroxymethylering in verschillende cellulaire contexten, waaronder veroudering en de evolutie van kanker. In vergelijking met sequencing-gegevens biedt massaspectrometrie een eenvoudige, snelle uitlezing, en iDEMS zou daarom nuttig kunnen zijn waar efficiëntie van cruciaal belang is, zoals in medische omgevingen en medicijn ontdekking studies.
“Onze resultaten laten zien hoe belangrijk nieuwe methoden zijn om de biologie door meer dan één lens te begrijpen. iDEMS is uiterst flexibel, omdat het kan worden gecombineerd met andere gevestigde methoden die in de moleculaire biologie worden gebruikt om naar het epigenoom te kijken. Deze methode voegt daarom een belangrijk hulpmiddel toe aan de reeks technologieën die epigenoomstabiliteit onderzoeken”, besluit Dr. Stewart-Morgan.
Referentie: « Quantifying propagation of DNA methylation and hydroxymethylation with iDEMS » door Kathleen R. Stewart-Morgan, Cristina E. Requena, Valentin Flury, Qian Du, Zoe Heckhausen, Petra Hajkova en Anja Groth, 12 januari 2023, Natuur celbiologie.
DOI: 10.1038/s41556-022-01048-x
